科学意义和理论依据： 猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus）属于I型冠状病毒，是有囊膜的单股正链RNA病毒[1]。该病毒可感染猪，导致以腹泻、呕吐、脱水为主要症状的猪流行性腹泻病[2]。自2010年冬天开始，PEDV在中国大范围流行，此次暴发具有感染性强、流行性广、致死率高、不易防控等特点，对我国的养猪业带来了巨大的经济损失[3]。我国研究人员通过流行毒株分离及全基因测序，证明流行毒株与传统毒株CV777相比基因组变异较大，尤其是S基因存在着碱基的突变、插入和缺失[4-8]。PEDV S蛋白在结合宿主受体、诱导机体产生中和抗体及促进病毒和细胞融合等方面发挥着重要的作用[9-13]。S蛋白是I型糖蛋白，分子量为180-220ku，由四部分组成，包括一个信号肽（1-18aa）、细胞外区域（19-1333 aa）、跨膜区（1334-1356aa）和一个短的细胞内区域[14]。S蛋白上有一个中和表位区域COE和三个线性中和表位，其中的两个位于S1，分别是748YSNIGVCK755和764LQDGQVKI771； 间接ELISA经常用于抗体的检测。其原理是将抗原包被固相载体上，加入待检样品，充分作用后加入酶标二抗，最后加入底物进行显色。Oh等将检测PEDV抗体的间接ELISA方法和血清中和试验相比较，结果证实间接ELISA敏感性高于血清中和试验[15]。Hou和Ren分别用大肠杆菌表达的PEDV N蛋白、M蛋白建立间接ELLISA方法，用于检测PEDV抗体，均具有较好的敏感性和特异性[16,17]。 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。 这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨蛋白质的精细结构、淋巴细胞亚群的表面新抗原、组织相容性抗原、和免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。 创新性： S蛋白共有三个中和表位区域，对其氨基酸分析发现，该区域疏水性较强，不利于原核表达。利用多种表达载体对包含有中和表位区域的S1蛋白进行分段原核表达，加入标签用于表达鉴定和蛋白纯化。 应用前景： 表达出含有中和表位区域的部分S1蛋白，主要有两个方面的用途。一方面是经纯化后的蛋白可用于ELISA方法的建立，检测PEDV变异毒产生的抗体，为临床上抗体的检测提供有利工具；另一方面，经纯化后的蛋白可用于单克隆抗体的制备，因为表达的蛋白含有中和表位，那么制备的单克隆抗体就具有中和活性，可直接用于治疗PEDV。 参考文献： [1]Pensaert MB, de Bouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine. Arch Virol 1978;58(3):243-7. [2]Brian DA, Baric RS. Coronavirus genome structure and replication. CurrTopMicrobiolImmunol 2005;287:1-30. [3]Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China. Emerg Infect Dis 2012 Jan;18(1):161-3. [4]Fan H, Zhang J, Ye Y, et al. Complete genome sequence of a novel porcine epidemic diarrhea virus in south China. J Virol 2012 Sep;86(18):10248-9. [5]Li W, Li H, Liu Y, et al. New variants of porcine epidemic diarrhea virus, China, 2011. Emerg Infect Dis 2012 Aug;18(8):1350-3. [6]Luo Y, Zhang J, Deng X, et al. Complete genome sequence of a highly prevalent isolate of porcine epidemic diarrhea virus in South China. J Virol 2012 Sep;86(17):9551. [7]Pan Y, Tian X, Li W, et al. Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China. Virol J 2012;9:195. [8]Zhao M, Sun Z, Zhang Y, et al. Complete genome sequence of a Vero cell-adapted isolate of porcine epidemic diarrhea virus in eastern China. J Virol 2012 Dec;86(24):13858-9. [9]Bosch BJ, de Haan CA, Rottier PJ. Coronavirus spike glycoprotein, extended at the carboxy terminus with green fluorescent protein, is assembly competent. J Virol 2004 Jul;78(14):7369-78. [10]Bosch BJ, van der Zee R, de Haan CA, et al. The coronavirus spike protein is a class I virus fusion protein: structural and functional characterization of the fusion core complex.J Virol 2003 Aug;77(16):8801-11. [11]Duarte M, Tobler K, Bridgen A, et al.Sequence analysis of the porcine epidemic diarrhea virus genome between the nucleocapsid and spike protein genes reveals a polymorphic ORF. Virology 1994 Feb;198(2):466-76. [12]Li BX, Ge JW, Li YJ. Porcine aminopeptidase N is a functional receptor for the PEDV coronavirus. Virology 2007 Aug 15;365(1):166-72. [13]Ma GG, Lu CP. [Two genotypes of Canine coronavirus simultaneously detected in the fecal samples of healthy foxes and raccoon dogs]. Wei Sheng Wu Xue Bao 2005 Apr;45(2):305-8. [14]Song D, Park B. Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines.Virus Genes 2012 Apr;44(2):167-75. [15]Hou XL, Yu LY, Liu J. Development and evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid protein for detection of porcine epidemic diarrhea (PEDV) antibodies. Vet Microbiol 2007 Jul 20;123(1-3):86-92. [16]Ren X, Suo S, Jang YS. Development of a porcine epidemic diarrhea virus M protein-based ELISA for virus detection. Biotechnol Lett 2011 Feb;33(2):215-20. [17]郭旋.猪流行性腹泻病毒的分离及间接ELISA的建立:广西大学; 2013. |
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